Mtengo wa Ct ndiye mawonekedwe ofunikira kwambiri owonetsera mawonekedwe a fulorosenti ya PCR.Amagwiritsidwa ntchito kuwerengera kusiyana kwa ma jini kapena nambala yakopi ya jini.Ndiye mtengo wa Ct wa fluorescence quantification ndi wotani?Kodi mungatsimikizire bwanji kuchuluka kwa mtengo wa Ct?
Kodi Ct Value ndi chiyani?
Panthawi ya kukulitsa kwa qPCR, chiwerengero chofananira cha mizere yokulitsa (Cycle Threshold) pomwe chizindikiro cha fluorescence cha chinthu chokulitsa chikafika pachimake cha fluorescence.C imayimira Cycle ndipo T imayimira Threshold.Mwachidule, mtengo wa Ct ndi kuchuluka kwa zozungulira zomwe zimayenderana ndi pomwe kukulitsa kwa template kumafikira kuchuluka kwazinthu mu qPCR.Zomwe zimatchedwa "kuchuluka kwa mankhwala" zidzafotokozedwanso pambuyo pake.
Kodi mtengo wa Ct umatani?
1.Ubale pakati pa kukulitsa kwachidziwitso, kuchuluka kwa template ndi mtengo wa Ct
Momwemo, majini mu qPCR amasonkhanitsidwa ndi kukulitsa kwapang'onopang'ono pambuyo pa kuchuluka kwa mikombero.Ubale womwe ulipo pakati pa kuchuluka kwa zozungulira zokulitsa ndi kuchuluka kwazinthu zomwe zimapangidwa ndi: Kuchulukitsa kwazinthu = kuchuluka kwa template yoyambira × (1+En) nambala yozungulira.Komabe, machitidwe a qPCR sakhala mumkhalidwe wabwino nthawi zonse.Kuchuluka kwa mankhwala okulitsa kukafika "kuchuluka kwazinthu zina", kuchuluka kwa zozungulira panthawiyi ndi mtengo wa Ct, ndipo ili mu nthawi yowonjezereka.Ubale pakati pa mtengo wa Ct ndi kuchuluka kwa template yoyambira: Pali mgwirizano wa mzere pakati pa mtengo wa Ct wa template ndi logarithm ya nambala yoyambira ya template.Kukwera kwa template yoyamba, kumachepetsa mtengo wa Ct;kutsika kwa template yoyambira, kukulitsa mtengo wa Ct.
2.Amplification curve, fluorescence threshold ndi zinthu zina za PCR
Kuchuluka kwazinthu zokulitsa za qPCR zimaperekedwa mwachindunji mu mawonekedwe a siginecha ya fulorosenti, ndiye kuti, piritsi lokulitsa.Kumayambiriro kwa PCR, kukulitsa kumakhala pansi pamikhalidwe yabwino, kuchuluka kwa zozungulira kumakhala kochepa, kuchulukira kwazinthu kumakhala kochepa, ndipo mulingo wa fluorescence sungathe kusiyanitsa bwino ndi maziko a fulorosenti.Pambuyo pake, fluorescence imawonjezeka ndikulowa mu gawo la exponential.Kuchuluka kwa mankhwala a PCR kungathe kudziwika panthawi inayake pamene machitidwe a PCR ali mu gawo lachidziwitso, lomwe lingagwiritsidwe ntchito ngati "chiwerengero china cha mankhwala", ndipo zomwe zili mu templateyi zikhoza kudziwika kuchokera ku izi.Chifukwa chake, mphamvu ya siginecha ya fluorescence yofananira ndi kuchuluka kwazinthu zamtundu wina ndi gawo la fulorosenti.
Kumapeto kwa PCR, mapindikidwe okulitsa samawonetsanso kukulitsa kwachidziwitso, ndikulowa mugawo lozungulira komanso gawo lamapiri.
3.Reproducibility of Ct values
Kuzungulira kwa PCR kukafika pa nambala yozungulira ya mtengo wa Ct, yangolowa kumene mu nthawi yeniyeni yokulirakulira.Panthawiyi, cholakwika chaching'ono sichinakulitsidwe, kotero kuti kubwereketsa kwa mtengo wa Ct ndikwabwino kwambiri, ndiko kuti, template yomweyi imakulitsidwa nthawi zosiyanasiyana kapena m'machubu osiyanasiyana nthawi imodzi.Kukulitsa, mtengo wopezeka wa Ct ndi wokhazikika.
1.Kukulitsa luso En
Kuchita bwino kwa PCR kumatanthawuza mphamvu yomwe polymerase imasinthira jini kuti ikulitsidwe kukhala amplicon.Mphamvu yokulitsa pamene molecule imodzi ya DNA isandulika kukhala mamolekyu awiri a DNA ndi 100%.Kuchita bwino kwamachulukidwe kumawonetsedwa ngati En.Pofuna kuwongolera kusanthula kwa nkhani zotsatila, zinthu zomwe zimakhudza kukulitsa bwino zimayambitsidwa mwachidule.
| Zinthu zosonkhezera | kufotokoza | Kodi kuweruza? |
| A. PCR inhibitors | 1. DNA ya template ili ndi zinthu zomwe zimalepheretsa machitidwe a PCR, monga mapuloteni kapena zotsukira.2. The cDNA pambuyo m'mbuyo transcript lili mkulu ndende ya template RNA kapena RT reagent zigawo zikuluzikulu, amenenso ziletsa wotsatira PCR anachita. | 1. Kaya pali kuipitsa kungaweruzidwe poyesa chiŵerengero cha A260 / A280 ndi A260 / A230 kapena RNA electrophoresis.2. Kaya cDNA imachepetsedwa molingana ndi chiŵerengero china pambuyo polemba mosintha. |
| B. Kupanga koyambirira kolakwika | Zoyambira sizimayendetsa bwino | Yang'anani zoyambira za ma primer-dimers kapena hairpins, zosagwirizana, ndipo nthawi zina zoyambira zoyambira. |
| C. Mapangidwe a pulogalamu yolakwika ya PCR | 1. Zoyambira sizingathetsere bwino2. Kutuluka kosakwanira kwa DNA polymerase 3. Kutentha kwa nthawi yayitali kwa DNA polymerase kunachepa | 1. Kutentha kwa annealing ndipamwamba kuposa mtengo wa TM wa primer2. Pre-denaturation nthawi ndi yochepa kwambiri 3. Nthawi ya gawo lililonse la zomwe zimachitika ndi nthawi yayitali kwambiri |
| D. Kusakanikirana kosakwanira kwa ma reagents kapena zolakwika za pipetting | M'machitidwe kachitidwe, kuchuluka kwazinthu za PCR kumakhala kokwera kwambiri kapena kosagwirizana, zomwe zimapangitsa kuti PCR ichuluke kwambiri. | |
| E. Amplicon Kutalika | Kutalika kwa amplicon ndikotalika kwambiri, kupitirira 300bp, ndipo mphamvu yokulitsa ndiyotsika. | Onetsetsani kuti kutalika kwa amplicon kuli pakati pa 80-300bp |
| F. Mphamvu ya qPCR reagents | Kuchuluka kwa DNA polymerase mu reagent ndikotsika kapena kuchuluka kwa ma ion mu buffer sikukwaniritsidwa, zomwe zimapangitsa kuti ntchito ya Taq enzyme isafike pachimake. | Kutsimikiza kwa kukulitsa bwino kwa curve yokhazikika |
2.Range ya Ct values
Mtengo wa Ct umachokera ku 15-35.Ngati mtengo wa Ct ndi wocheperapo 15, amaonedwa kuti kukulitsa kuli mkati mwa nthawi yoyambira ndipo chigawo cha fluorescence sichinafike.Momwemo, pali mgwirizano wa mzere pakati pa mtengo wa Ct ndi logarithm ya nambala yoyamba ya template ya template, ndiko kuti, curve yokhazikika.Kupyolera muzitsulo zokhazikika, pamene mphamvu yokulitsa ndi 100%, chiwerengero cha Ct chowerengera chiwerengero cha kopi imodzi ya jini chili pafupi ndi 35. Ngati ndi yaikulu kuposa 35, chiwerengero choyambirira cha template ndi theory yochepa kuposa 1, chomwe chingaganizidwe kukhala chopanda tanthauzo.
Pamitundu yosiyanasiyana ya jini ya Ct, chifukwa cha kusiyana kwa nambala ya kukopera kwa jini ndi kukulitsa bwino mu kuchuluka kwa template yoyambirira, ndikofunikira kupanga mayendedwe okhazikika a jini ndikuwerengera kuchuluka kwa mzere wa jini.
3.Zinthu zochititsa chidwi za mtengo wa Ct
Kuchokera paubwenzi pakati pa chiwerengero cha maulendo okulitsa ndi kuchuluka kwa mankhwala: kuchuluka kwa mankhwala okulitsa = kuchuluka kwa template yoyamba × (1 + En) nambala yozungulira, zikhoza kuwoneka kuti pansi pazikhalidwe zabwino, kuchuluka kwa template yoyambirira ndi En kudzakhala ndi zotsatira zoipa pa mtengo wa Ct umakhudzidwa.Kusiyana kwa mawonekedwe a template kapena kukulitsa bwino kumapangitsa kuti mtengo wa Ct ukhale wokulirapo kapena wocheperako.
Mtengo wa 4.Ct ndi waukulu kwambiri kapena wochepa kwambiri
Nthawi yotumiza: Feb-22-2023
